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徠卡共聚焦課堂：光譜成像

發布時間：2022-06-01

分色方法

多通道熒光成像的目的是將各種熒光染料發射的光子收集到獨立的檢測通道中。為此，有必要對全發射光譜的組分進行空間分離，即將這些組分定位到不同的方向。傳統上，這種分離是通過“次級二向色鏡”（將激發與發射分離的主要分光器，稱“主分光器”）進行的。除此之外，還可以通過使用棱鏡或光柵來分離光子。根據光子的顏色對光子進行物理分類，這是一種原始的真彩分色方法。如果一次分色不充分，則可以通過數學拆分來補充。

次級二向色鏡

自1970年以來，多通道熒光顯微技術在生物顯微技術領域的需求日益增加。在最簡單的情況下，用于單通道設置的濾光片和二向色鏡在本質上可以記錄多色成像，例如，藍色或紫外線激發下的綠色和黃色/橙色熒光（比較經典的一個例子是富爾根染色，它可以通過不同的發射顏色來辨別DNA和RNA）。寬場顯微技術通過使用彩色相機來實現這一效果。有時，特別是對于定量測量，光路被一分為二，兩個通道在同一芯片上并行成像。更優的解決方案是同時并行使用兩個或多個相機。

在共聚焦掃描顯微技術中，不可能在同一個檢測單元上分割檢測信號。因此，通過添加第二個（第三個……）光電倍增管，立即實現了多通道熒光成像。并行記錄數據，數據可以直接顯示在屏幕上，例如，在檢測的3個顏色通道中，或以電子方式存儲以供以后分析。要顯示3個以上的通道，信息必須分布在3個可用的檢測通道中，這不可避免地會導致顏色拆分效果和信號強度的損失。然而，現代顯微技術不僅僅要求得到清晰的圖像，還要求對其進行定量測量。在定量測量中，只要通道數量不超過樣品中熒光染料物質的種類，任何數量的通道都是有意義的。

圖1：帶有次級二向色鏡的4通道共聚焦掃描顯微鏡的布局圖（徠卡，1995年）。L1和L2設計為“濾光片輪”，而M是固定反射鏡（適用于3通道系統）或固定二向色鏡（適用于4通道系統）。

將發射不同顏色的熒光染料發射到一組傳感器，最顯而易見的方法是使用二向色鏡。二向色鏡會反射比指定波長λ0更短波長的光，并能透射比λ0更長波長的所有顏色的光。這適用于“長通二向色鏡”。“短通二向色鏡”會透射較短波長的光并反射光譜中較紅部分的光。在圖2中，一組三個次級二向色鏡1、2和3用于將全光譜分成4個不同的方向，傳感器隨后可以在其中收集4個不同的通道。必須根據所用熒光染料的光譜發射特性來選擇次級二向色鏡。因此，給定的一組次級二向色鏡可能適合許多發射方式類似的熒光染料，但如果熒光染料組合的發射特性顯著不同，則不適用。

為解決這一問題，使用次級二向色鏡進行分色的系統在每個分色位置都配備了濾片轉輪或滑塊。它們配備了一系列不同的二向色鏡，允許（有限）數量的不同波段傳遞給傳感器。顯然，這種解決方案不是很靈活，需要大量的維護工作和微調（預計至少保持穩定數月）。如果安裝許多激光線，則潛在發射帶的數量將會增加——因此需要的次級二向色鏡的數量也會增加。如果使用白激光，僅依靠發射濾光片的方法將無法完美適配，只能使用連續可調的設備才能發揮白激光的優勢。圖1表明了1995年次級二向色概念的實現。

圖2：二向色鏡的色散。主分光器將激發與發射分離。隨后通過次級二向色鏡1、2和3將發射分成四個方向（本例）。常規二向色鏡反射短波長的光并透射“更紅”顏色的光，盡管相反的特性也同樣可能。

棱鏡的色散

圖3：基于棱鏡的共聚焦檢測模塊示意圖，該模塊具有可單獨調節波段的5個通道，用于發射收集。1）棱鏡，2）滑塊，3）檢測器

艾薩克·牛頓爵士在其1704年出版的《光學》一書中描述了最古老的（有目的的）光分色方法：使用棱鏡。本文的題圖就是牛頓那本書的插圖。我們如今的解釋是，在不同光學介質的邊界處，較短波長的光將比較長波長的光的衍射更強（作出一個簡單的結論）。如果將不同顏色混合后（如一組熒光染料組合發射），穿過棱鏡，則組合發射光的光譜就會被分解。

分解強度取決于多個技術參數，但與樣品或傳感器無關。這是一個非常有效和直接的解決方案，可以讓一組熒光染料發射指向不同方向，這樣就可以記錄下來。在最簡單的情況下，只需沿著光譜放置一系列檢測器。這一概念已經實現了，但在收集效率和靈活性方面還存在嚴重缺陷。多波段設備是更好的解決方案，對每個要記錄的傳感器，其允許單獨選擇全光譜的任何部分。

棱鏡具有全光譜（平面）透射的優勢，即棱鏡（在指定的光譜范圍內）沒有吸收調制。透射和色散與偏振方向無關。這是一個重要的定律，因為熒光染料的發射總是非偏振的。最后，色散僅發生在一個方向上——在選擇的階數中，沒有其他“階數”可以降低色散的強度。

本文對色散光譜的線性問題進行了討論。基于棱鏡的光譜與波長不呈線性關系。這對于技術設計而言不是問題，只要不使用線性檢測器組合，例如多陽極光電倍增管或類似設備。

圖4：棱鏡的色散。由于玻璃棱鏡的折射能力取決于衍射光的波長，因此不同波長的組合將被分散。在白光的情況下，色散圖案是一個連續的光譜。多重標記熒光樣品的發射將產生一個在熒光染料發射最大值處具有最大值的光譜。這一技術是通過單個傳感器收集盡可能多的單一染料的發射光。

光柵色散

圖5：光柵與棱鏡的效率比較。光柵（藍色曲線）針對“閃耀”波長進行了優化，該波長兩側的效率都會下降。而且，特定的偏振方向的透過效率很好（在閃耀時）。在短波段內，垂直偏振顯著下降。棱鏡的效率主要取決于所使用的玻璃類型，并且在長程范圍內是平面且非偏振的（此處：用于可見光發射的冕玻璃）。

除棱鏡以外，另一種色散元件是光柵。透射光柵和反射光柵都在使用。用入射光束照明時，光柵的周期性結構將使光偏轉到不同方向（通過干涉過程）。

直線方向（0階）不顯示任何色散。通常選擇的方向是一階。在這里，光分散為光譜，非常類似于棱鏡中的色散。然而，還有更多的階數，如2階和更高階，但在光柵法線的另一側，也有反射1階到N階。光柵制作技術是將盡可能多的能量集中在一個單一的階數中。

對于平行或垂直于線（凹槽）方向的偏振光，光柵的表現也迥然不同。雖然垂直波在最佳情況（取決于各種參數）下可以產生相當有效的光譜，但平行波在距離閃耀波長兩個八度范圍內顯著下降——大約降為零。由于熒光是非偏振的，因此用垂直效率和平行效率的平均值來描述總效率。在可見光波段200nm范圍內，下降到30%是很常見的。

對于光子探測效率（光子收集性能）至關重要的共聚焦顯微鏡而言，這使得光柵成為非常低效且不合適的色散器件。如果該技術實現，通常會附加一系列額外的設計元件，試圖引導丟失的光子進入傳感器（有時稱為“光子回收器”）。

更復雜的是，與棱鏡相比，光柵的雜散光損失要大得多。