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顯微鏡分辨率：概念、因素和計算
發布時間：2021-09-01
分辨率與數值孔徑
數值孔徑（NA）與光通過的介質的折射率（n）以及給定物鏡的孔徑角（α）有關（NA=n × sin α）。顯微鏡的分辨率不僅取決于物鏡的NA，還取決于整個系統的NA，要把顯微鏡聚光鏡的NA也納入考慮。在顯微鏡系統中，所有光學元件都正確對齊、具有相對較高的NA值并且相互協調工作，可以分辨出更多的圖像細節。分辨率還與標本成像所用的光波長有關；波長越短，可分辨的細節越多，波長越長則分辨細節越少。
在處理分辨率時需要考慮三個數學概念：‘阿貝衍射極限’、‘艾里斑’和‘瑞利判據’。以下按時間順序逐一介紹。
George Biddell Airy與‘艾里斑’（1835）
George Biddell Airy（1801-1892）是英國數學家和天文學家。1826年，25歲的他被任命為三一學院的數學教授，兩年后，被任命為新劍橋天文臺的天文學教授。1835年到1881年期間，他是“皇家天文學家”，月球和火星上各有一處以他的名字命名的隕石坑。
1835年，他在劍橋哲學學會學報上發表了一篇題為《有關圓孔徑物鏡的衍射》的論文。Airy在論文中以一個天文學家的視角描述了通過一個精良的望遠鏡觀察到的恒星周圍的光環或者射線的形狀及亮度。盡管是從不同的科學領域發表的文章，但這些觀察結果與其他光學系統，特別是顯微鏡存在著關聯。
艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系統中由圓形孔徑形成的聚焦的光點。如圖1所示，其呈現為中央亮點和周圍是明暗相間的同心環（更準確地說，這是艾里圖案Airy pattern）。
衍射圖案由光的波長和光所通過的孔徑大小決定。艾里斑的中心點含有大約84%的光強，其余16%分布于環繞該點的衍射圖案中。當然，用顯微鏡進行觀察時標本上會有許多光點，因此基于大量的艾里圖案來考慮，而非如“艾里斑”描述的單個光點來考慮是更妥當的方式。
圖1右所示的艾里圖案三維表示又稱為‘點擴散函數’。
圖1：艾里圖案，或稱艾里斑的典型現象，由其中心的理想的光點和環繞的衍射環組成。
Ernst Abbe與‘Abbe衍射極限’（1873）
Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德國數學家和物理學家。他與Carl Zeiss共同創立了“蔡司光學工作室”即現在的蔡司公司。除此之外，他還在1884年聯合創辦了Schott Glassworks。Abbe還是定義數值孔徑這一術語的首位學者。1873年，Abbe發表了自己的理論和公式對顯微鏡的衍射極限進行了解釋。Abbe發現，標本圖像由許多重疊的、多強度且存在衍射極限的點（或艾里斑）所組成。
要提高分辨率（d=λ/2 NA），標本必須使用波長（λ）更短的光來進行觀察，或者通過折射率相對高的成像介質來進行觀察，又或者使用NA較高的光學組件來進行觀察（或者將全部3種因素組合起來）。
但即便將所有這些因素都考慮在內，顯微鏡系統的極限依然受到限制，因為系統復雜性，波長低于400 nm的光在玻璃中的傳播特征，以及整套顯微鏡需要達到較高的NA。理想光學顯微鏡的橫向分辨率限制在200 nm左右，而軸向分辨率約為500 nm（有關分辨率極限示例，請參見下文）。
John William Strutt與‘瑞利判據’（1896）
第三代瑞利男爵John William Strutt（1842-1919）是一名英國物理學家，也是一位高產學者。他一生編寫了多達466篇論文，包括430 篇科研論文。他的論文涉獵極廣，各種主題都有，如鳥類飛行、心理研究、聲學等等。1895年，他發現了氬并憑借這一發現于1904年獲得諾貝爾獎。
Rayleigh以George Airy的理論為基礎上并進一步延伸，于1896年創造了“瑞利判據”理論(Rayleigh Criterion)。瑞利判據（圖2）在衍射極限系統當中定義了分辨率極限，換言之，就是何時能夠將2個光點相互區分或分辨。
使用艾里斑理論，如果2個單獨艾里斑的衍射圖案不重疊，則就可以輕松區分、‘分辨’兩者并認定滿足瑞利判據（圖2，左圖）。而當艾里斑的中心直接重疊于另一個艾里斑的第一理想的衍射圖案時，則兩者認定為‘剛好分辨’，同時依然可以區分為2個獨立的光點（圖2，中圖）。如果艾里斑再繼續相互接近，則兩者無法滿足瑞利判據，因此“無法被分辨”為2個不同的光點（或者標本圖像中的單獨細節；圖2，右圖）。
圖2：分辨率極限（按瑞利判據來定義），兩個單獨艾里斑的重疊衍射圖案：左圖：分辨良好；中圖：剛好分辨；右圖：未分辨
如何計算顯微鏡的分辨率
將以上全部理論都考慮在內就可以明顯看出，在計算分辨率的理論極限時需要考慮很多因素。分辨率還取決于樣本性質。我們來看一下使用阿貝衍射極限以及使用瑞利判據進行的分辨率計算。
首先應當要牢記：
NA= n x sin α
式中n為成像介質的折射率，α是物鏡孔徑角的一半。物鏡的理想的孔徑角大約為144º。該角度一半的正弦為0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為1.52，則物鏡的理想的NA為1.45。如果使用‘干式’（無浸沒）物鏡，則物鏡理想的NA為0.95（因為空氣的折射率為1.0）。
橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為：
d= λ/2 NA
式中λ 是標本成像所用的光波長。如果使用514 nm的綠光及NA為1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）極限將達到177 nm。
軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為：
d= 2 λ/NA2
同樣的，如果我們假設通過波長514 nm的光來觀察標本且物鏡NA數值為1.45，則軸向分辨率為488 nm。
在阿貝衍射極限的基礎上，瑞利判據稍稍得到了細化：
R= 1.22 λ/NAobj+NAcond
式中λ為標本成像用的光波長。NAobj 為物鏡NA。NAcond為聚光鏡NA。‘1.22’是一個常系數。該數值根據Rayleigh的貝塞爾函數研究推導得出。這些主要用于對系統當中的問題，例如波的傳遞，進行計算。
將聚光鏡的NA考慮在內，空氣（折射率為1.0）通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質。假設聚光鏡的孔徑角為144º，則NAcond數值將等于0.95。
如果使用514 nm的綠光，油浸物鏡的NA為1.45，聚光鏡的NA為0.95，則分辨率的（理論）極限將達到261 nm。
如上所述，用于對標本成像的光波長越短，可以分辨的細節越多。因此如果使用400 nm的理想的可見光波長，油浸物鏡NA為1.45，聚光鏡NA為0.95，則R等于203 nm。
要在顯微鏡系統當中達到（理論）分辨率的理想值，每個光學組件都應當具備理想的可用的NA（把孔徑角納入考慮）。此外，觀察標本所用的光波長越短則分辨率越高。最后，整個顯微鏡系統都應當準直對齊。
